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  免疫組織化學(xué)方法
 
 （一）酶標(biāo)記抗體組化法

   酶標(biāo)抗體組化技術(shù)是一種綜合定性、定位和定量，將形態(tài)、機(jī)能和代謝密切結(jié)合為一體的研究和檢測(cè)技術(shù)。在原位檢測(cè)出病原的同時(shí)，還能觀(guān)察到組織病變與該病原的關(guān)系，確認(rèn)受染細(xì)胞類(lèi)型，從而有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)理和病理過(guò)程。 

1、基本原理

   酶標(biāo)抗體技術(shù)是通過(guò)共價(jià)鍵將酶連接在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位，根據(jù)酶標(biāo)記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯(lián)法（多步法）等，用于標(biāo)記的抗體可以是用免疫動(dòng)物制備的多克隆抗體或特異性的單克隆抗體，是特異性強(qiáng)的價(jià)的單克隆抗體。直接法是將酶直接標(biāo)記在*抗體上，間接法是將酶標(biāo)記在第二抗體上，檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。目前通常選用免疫酶組織化學(xué)間接染色法。

（1）標(biāo)本的制備和處理

   用于酶標(biāo)抗體組化技術(shù)的標(biāo)本有組織切片（冷凍切片和石蠟切片）、組織壓印片。標(biāo)本的制作和固定與熒光抗體技術(shù)相同，但尚需要一些特殊處理。 

（2）標(biāo)記酶

用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下幾點(diǎn)：

① 酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于在光鏡或電鏡下觀(guān)察。

② 所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周?chē)M織彌散，影響組織學(xué)定位。

③ 較易獲得的酶分子，有商品出售。

④ 中性 pH 時(shí)，酶應(yīng)穩(wěn)定，酶標(biāo)記抗體后，保存 1-2 年活性不應(yīng)改變，且酶的催化活性（ Turnover ）越高越好。

⑤ 酶標(biāo)過(guò)程中，酶與抗體連接，不能影響二者的活性。

⑥ 被檢測(cè)組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類(lèi)似物質(zhì)。 

   其中 ① 、② 兩點(diǎn)zui重要，因?yàn)槿菀罪@示的酶并非均能形成不可溶性的復(fù)合物。一般認(rèn)為，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）較佳，是zui常用的一種酶。 

除 HRP 外，堿性磷酸酶（ALP）和葡萄糖氧化酶（GOD）也較常用。

（3）底物顯色劑

① DAB （3，3-二氨基聯(lián)苯胺）：顯色后陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色。

② AEC （3，氨基-9- 乙基卡巴唑）：顯色后陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈紅色或紫紅色。

2、以 PRRSV 為例介紹一下染色程序。

（1）切片準(zhǔn)備：將低溫保存的切片37 ℃預(yù)熱 5分鐘 。

（2）常規(guī)脫蠟： 二甲苯15分鐘；100% 乙醇 5分鐘；100%乙醇1分鐘；90% 乙醇 1分鐘；75% 乙醇 1分鐘。

（3）抑制內(nèi)源酶：1% 鹽酸酒精（75% 乙醇 99mL 加 1mL 鹽酸）作用10分鐘； 3%過(guò)氧化氫水溶液作用15分鐘。

（4）蒸餾水洗 2 次。 

（5）用 0.05% 胰酶37 ℃消化2分鐘。 

（6）PBS洗2次，擦干周?chē)笥媒M化（蠟）筆沿切片周邊畫(huà)一個(gè)圈 。 

（7）封閉：正常馬血清1：20倍稀釋?zhuān)?37 ℃ 孵育20分鐘。

（8）加一抗（1 : 800倍稀釋的PRRSV單克隆抗體 Mab 11），37 ℃孵育1小時(shí)或37 ℃孵育0.5小時(shí)后4 ℃過(guò)夜。對(duì)照片不加一抗。 

（9）PBS 洗 3 次。

（10）加二抗（HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 1 : 100X 稀釋?zhuān)?7 ℃孵育1小時(shí)。 

（11）PBS洗3 次。 

（12）加AEC顯色5~10分鐘。 

（13）蘇木素襯染10秒鐘。

（14）自來(lái)水洗2分鐘。

（15）待切片自然干燥后用水溶性封片劑封片。

（16）鏡檢、觀(guān)察記錄結(jié)果。

（二）葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫檢測(cè)技術(shù) 

   葡萄球菌蛋白A（SPA）是一種從金葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，由于它的一些免疫學(xué)特性，使其成為免疫學(xué)上一種極為有用的工具。葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫檢測(cè)技術(shù)是根據(jù)它能與多種動(dòng)物IgG的Fc 端結(jié)合的原理，用SPA標(biāo)記物（酶、熒光素、放射性物質(zhì)等）顯示抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的各種免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。 

1、基本原理 

   SPA 具有和人及多種動(dòng)物如豚鼠、兔、豬、犬、小鼠、猴等 IgG 結(jié)合的能力，可解決不同動(dòng)物檢測(cè)時(shí)，需分別標(biāo)記相對(duì)應(yīng)的二抗的問(wèn)題。 SPA結(jié)合部位是Fc段，這種結(jié)合不會(huì)影響抗體的活性。 SPA具有的結(jié)合力是雙價(jià)的，每個(gè)SPA分子可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)IgG分子，也可一方面同IgG相結(jié)合，一方面與標(biāo)記物如熒光素、過(guò)氧化物酶、、膠體金和鐵蛋白等相結(jié)合。但需注意的是SPA 對(duì) IgG 免疫球蛋白亞型的結(jié)合有選擇性，如SPA與人IgG亞型：IgG 1、IgG 2和IgG 4有結(jié)合力，不結(jié)合IgG 3。只結(jié)合IgA 2 ，而不結(jié)合 IgA 1。SPA與禽類(lèi)血清IgG不結(jié)合。因此應(yīng)注意可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果。SPA 常用 HRP 標(biāo)記，可應(yīng)用于間接法。

2、染色程序

染色程序基本同酶標(biāo)抗體法，僅二抗改用 SPA-HRP。

（三） 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判定 

1、對(duì)照的設(shè)立

  設(shè)立對(duì)照的目的在于證明和肯定陽(yáng)性結(jié)果的特異性，排除非特異性疑問(wèn)。主要是針對(duì)*抗體對(duì)照，常用的對(duì)照有陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。 

（1）陽(yáng)性對(duì)照是用已知抗原陽(yáng)性的切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，對(duì)照切片應(yīng)呈陽(yáng)性結(jié)果。證明整個(gè)染色程序符合要求，尤其當(dāng)待檢標(biāo)本呈陰性結(jié)果時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照就更加重要。 

（2）陰性對(duì)照是用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對(duì)照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，另外空白、替代、吸收和抑制試驗(yàn)均為陰性對(duì)照。當(dāng)陰性對(duì)照成立時(shí)，才能判定檢測(cè)結(jié)果，主要用于排除假陽(yáng)性。